Southern杂交

实验原理

      Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNAl片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNAl片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放l射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

4、其它说明

阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，荧光定量pcr，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，fish检测，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

基因组甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色谱(Hi gh-performanceLi qui dChromatography，实时荧光定量pcr， HPLC)HPLC是- -种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲l基化水平。该方法由Ruo等1980年首l次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢l氟酸水解成碱基，陕西pcr，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC 5C)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。这是一种检测DNA甲l基化水平的标准方法。

2.高l效毛细管电泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis， HPCE)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用HIPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。

fish检测-英瀚斯(在线咨询)-陕西pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是一家从事“组织病理,细胞生物,分子生物学平台,动物模型科研外包服务”的公司。自成立以来，我们坚持以“诚信为本，稳健经营”的方针，勇于参与市场的良性竞争，使“英瀚斯”品牌拥有良好口碑。我们坚持“服务至上，用户至上”的原则，使英瀚斯在技术合作中赢得了客户的信任，树立了良好的企业形象。 特别说明：本信息的图片和资料仅供参考，欢迎联系我们索取准确的资料，谢谢！