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18.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?
答:理论上分析型PAGE变性电泳,PCR,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,pcr检测,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。
19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?
答:下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5"端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C 左右。
有用的荧光染料参数
分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中,通过特定的标记,可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。
实验流程:细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。
结果示例:
![](http://img3.dns4.cn/pic1/316162/p6/20200629114522_9176_zs_sy.png)
细胞荧光染
通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。
RNA提取
1.弃去培养液,用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS,用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。
6.往每个EP管中加入250ul,剧烈震荡30s, 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心,转速: 13500转1分钟,时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中,再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心,转速: 13500转1分钟,时间: 10min.
11.弃去.上清液,加1m175%乙醇,pcr,轻摇7]。
12. 4C离心,10600转/分钟,时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解,-80C保存。进行逆转录前测浓度。
组织RNA提取
1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨,以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
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